詹姆斯-韋伯太空望遠鏡的科學目標涵蓋了非常廣泛的主題，另外它還將幫助解決天文學中的許多公開問題。它們則可以被分為四個主要領域。
其他世界
關鍵問題：行星系統是在哪裡以及如何形成和演變的？
由於快速發展的系外行星研究領域–太陽系以外的行星–韋伯將能對一些關鍵問題做出貢獻，比如地球是獨一無二的嗎？跟我們相似的其他行星系統是否存在？我們在宇宙中是孤獨的嗎？
韋伯將詳細研究各種各樣的系外行星的大氣層。它將搜索跟地球相似的大氣層以及關鍵物質的特徵如甲烷、水、氧氣、二氧化碳和複雜的有機分子，並希望能找到生命的組成部分。通過這種方式，韋伯將補充歐空局的大氣遙感紅外系外行星大型調查(Ariel)，後者將研究系外行星是由什麼構成的、它們如何形成以及它們如何演變。
在離家更近的地方，韋伯還將研究我們自己太陽系中的系外行星。許多系外行星跟海王星和天王星相似，因此研究我們自己太陽系附近的行星可以為更好地理解一般的行星形成提供新的見解。
恆星的生命周期
關鍵問題：恆星是如何和在哪裡形成的？是什麼決定了它們形成的數量和它們各自的質量？恆星是如何死亡的，它們的死亡又對周圍的介質有何影響？
恆星將宇宙中的簡單元素轉化為較重的元素並通過超新星的爆炸將它們傳播到整個宇宙。在光譜的紅外部分進行觀測，韋伯將能透過新生恆星周圍的塵埃包層。它極高的靈敏度也將使天文學家能直接研究微弱的原恆星核心–恆星誕生的最早階段。
韋伯將研究褐矮星，即質量介於行星和恆星之間的暗淡天體，其本身的質量不足以啟動熱核反應並成為成熟的恆星。韋伯將確定塵埃和氣體雲如何及為什麼會坍縮成恆星或成為氣體巨行星或褐矮星。
韋伯還將看到最大質量的恆星作為超新星爆炸，並留下更多的塵埃和氣體雲，以及豐富宇宙的珍貴重金屬，以形成新一代的恆星。
早期宇宙
關鍵問題：早期宇宙是什麼樣子的？第一批恆星和星系是什麼時候出現的？
在人類歷史上，我們第一次有機會直接觀察第一批恆星和星系的形成。韋伯的紅外線視野使它成為一台強大的時間機器，它將回望135億年，這超越了哈勃“深場”的極限。據悉，哈勃“深場”向我們展示的是年輕的星系，當時它們只有幾億年的歷史且很小、很緊湊、不規則。韋伯的紅外敏感度不僅可以追溯到更遠的年代，而且還將揭示出關於早期宇宙中的恆星和星系的更多信息。哈勃看的是“幼兒期”的星系，而韋伯將看到“嬰兒期”的星系。
韋伯的數據還將回答一個引人注目的問題：黑洞在早期是如何形成和發展的以及它們對早期宇宙的形成和演變有什麼影響。
隨時間推移的星系
關鍵問題：第一個星系是如何隨時間演變的？我們能從暗物質和暗能量中了解到什麼？
今天的宇宙中充滿了星系–由數千億顆恆星組成的宇宙島嶼。它們的大小和形狀大不相同，並掌握着它們如何形成和演變的線索。在最初的幾十億年裡，宇宙是非常活躍的，星系經歷了合併事件或被撕裂並夾雜着短命大質量恆星的超新星爆炸。在紅外波長下運行，韋伯可以觀察到這些原始星系的大部分光線並揭示出它們被塵埃籠罩的恆星誕生和吸收物質的黑洞。
韋伯還將揭示暗物質即充滿宇宙但不直接可見的物質。通過這種方式，韋伯將補充歐空局的Euclid任務，該任務將繪製宇宙的幾何圖形並專門用於研究暗能量（宇宙加速膨脹背後的力量）和暗物質。