揭開埃博拉病毒“複製機器”的面紗

今年9月，非洲烏干達再次出現新的埃博拉疫情。這意味着埃博拉病毒這把“達摩克利斯之劍”依然懸在頭頂，時刻威脅着人們的健康。科學界一直想研製一款成本低、有利於推廣的廣譜性抗埃博拉病毒小分子藥物，但卻缺乏理論指導。埃博拉病毒聚合酶負責病毒基因組複製過程，且具有較高保守性，是研發廣譜性藥物的重要靶標。

但埃博拉病毒聚合酶的分子量大、不穩定、易降解，其三維結構的解析一直是世界性難題。

現在，中國科學院微生物所高福院士團隊和施一團隊合作，首次解析了埃博拉病毒聚合酶複合物的三維結構，為從分子水平理解埃博拉病毒複製機制奠定了關鍵理論基礎。他們還解析了老葯蘇拉明能有效抑制埃博拉病毒聚合酶活性的分子機制，為抗埃博拉病毒的藥物開發提供了新的靶點和方向。相關研究9月28日發表於《自然》雜誌。

現形：結構穩定的“複製機器”

埃博拉病毒病是由埃博拉病毒引起的烈性急性傳染病，主要在人或靈長目動物之間傳播。自1976年首次在非洲扎伊爾和蘇丹被發現后，埃博拉病毒已在非洲肆虐了近50年，暴發過30多次，造成數萬人死亡，病死率最高可達90%。

其中，2014-2016年暴發於西非國家的埃博拉疫情，是有史以來最嚴重的一次，共導致約2.9萬人感染，超過1.1萬人死亡。2018至2020年暴發於剛果民主共和國的埃博拉疫情也導致3481人感染，2299人死亡。2021年在西非國家幾內亞再次發現埃博拉病毒活躍跡象，提示病毒可能存在潛伏感染。

這些數據說明，對埃博拉病毒仍需加強科學研究。

目前，已有兩款上市的扎伊爾型埃博拉病毒抗體藥物，其作用靶點是埃博拉病毒表面刺突糖蛋白（GP）。

“已上市的抗體藥物具有特異性，不能用於治療其他類型埃博拉病毒以及馬爾堡病毒等絲狀病毒。此外，病毒表面的GP蛋白在宿主免疫壓力下也容易發生免疫逃逸，有可能造成抗體藥物效果變差甚至無效。”論文通訊作者施一對《中國科學報》說。

此外，他表示，由於抗體藥物製造成本比較高，需要低溫儲存，不利於在非洲地區普及推廣使用。開發有效安全的廣譜性抗病毒小分子藥物是應對不同類型埃博拉病毒和其他絲狀病毒感染的重要研究方向。

科學家已經發現，埃博拉病毒基因組的轉錄與複製過程由病毒聚合酶蛋白L和其他輔助蛋白形成的複合物來共同完成。由於聚合酶複合物在不同的絲狀病毒中具有高度保守性，是非常理想的廣譜性抗病毒藥物開發靶點。

此前的研究還發現瑞德西韋和法比拉韋，這兩個針對埃博拉病毒聚合酶的核苷類小分子藥物具有良好的體外抗病毒活性。然而，其臨床效果卻並不理想。目前，臨床上尚未有批准可用於治療埃博拉病毒感染的小分子藥物。

那麼，現有的靶向聚合酶藥物如何進行結構優化？能否針對聚合酶保守位點開發新的藥物來治療埃博拉病毒病？

回答這些問題，迫切要求研究人員弄清楚埃博拉病毒的複製機制。

埃博拉病毒屬於絲狀病毒科，基因組為不分節段的負鏈RNA，長約19 kb，包含7個開放閱讀框。過去近10年，科學家對這種病毒的複雜結構已經有了一些了解，比如它的RNA基因組被核蛋白（NP）包裹，形成核糖核蛋白複合體（RNP），進一步與聚合酶蛋白（L）、病毒輔助蛋白（VP35）、轉錄激活蛋白（VP30）和核衣殼相關蛋白（VP24）結合，形成螺旋狀核衣殼結構，並被基質蛋白（VP40）環繞，進一步與病毒表面GP蛋白形成完整病毒顆粒。

解析埃博拉病毒聚合酶的三維結構卻是全球病毒學家面臨的一個挑戰。經過多年的嘗試摸索，施一與高福合作研究團隊成功表達純化獲得了埃博拉病毒聚合酶複合物蛋白（L-VP35複合物），並利用冷凍電鏡技術解析其高分辨率三維結構。他們發現，埃博拉病毒的聚合酶L蛋白會與VP35蛋白四聚體形成穩定的複合物，進行病毒基因組複製和轉錄。

那麼，L-VP35聚合酶複合物如何介導這一功能呢？研究團隊在原子層面對這個問題進行了深入探索。

入微：揭開“共舞”機制

通過深入觀察，研究團隊對聚合酶複合物的動態構象變化有了微觀水平的了解。

作為病毒“複製機器”的核心，聚合酶在生成子代RNA的過程中涉及到多種構象變化，從而促進產物順利合成，其中最重要的構象變化是從起始態到延伸態的轉變。

此前的研究表明，聚合酶從起始狀態進入到延伸狀態時，酶活中心的兩個關鍵結構元件——啟動環（priming loop）和支撐螺旋（supporting helix）必須發生巨大的構象調整，才能保證產物鏈有足夠的空間進行延伸。否則，就會與產物鏈發生空間位阻。

研究者通過改變冷凍電鏡的制樣條件，捕捉到了埃博拉病毒聚合酶處於延伸狀態時的精細結構。他們發現，在處於延伸構象時，啟動環完全縮回到加帽結構域，而支撐螺旋也會遠離聚合酶的活性中心，從而為模板/產物雙鏈RNA提供足夠的空間進行延伸。

那麼，病毒VP35蛋白如何與L聚合酶“共舞”呢？

研究發現，在病毒複製過程中，VP35會像“橋樑”一樣，起到連接L蛋白和病毒RNP的功能。“當L聚合酶進行病毒基因組複製時，是以螺旋形的RNP為模板，而不是以裸露的RNA為模板，這時VP35主要行使的是分子伴侶功能，介導L聚合酶以RNP為單元進行複製。”施一說。

他向《中國科學報》解釋，VP35四聚體除了中間的寡聚化結構域，兩頭分別有四個N端（氨基端）結構域和四個C端（羧基端）結構域，其中一個C端結合到L蛋白上，進一步穩定L聚合酶與VP35四聚體的結合，同時另外七個端會像“八爪魚的觸角”一樣，幫助L聚合酶在RNP結構上發生滑動，以及結合單體狀態下的病毒RNP蛋白，阻止其與宿主RNA發生非特異性相互作用，保證單體NP蛋白能夠用於子代RNP的生成。

“如果沒有VP35，L聚合酶蛋白就沒法進行基因組複製和轉錄過程。”施一表示，如果能夠阻斷L蛋白和VP35的結合，病毒將無法複製。

洞見：指導藥物設計與優化

開發能有效抑制埃博拉病毒的小分子藥物一直是國際熱點，也是難點。

施一表示，了解L-VP35複合物相互作用界面的分子細節，為進一步開發靶向聚合酶的藥物提供了新的靶點以及重要指導信息。

據介紹，埃博拉病毒聚合酶活性結構域和加帽結構域與呼吸道合胞病毒（RSV）和狂犬病毒（RABV）等其他（基因組）不分節段的負鏈RNA病毒聚合酶結構相似，說明這類病毒聚合酶在進化過程中具有保守性。

值得注意的是，研究者指出，埃博拉病毒聚合酶的N端結構域區域具有一個絲狀病毒特有的插入結構域，並在埃博拉病毒聚合酶發揮活性時是必不可少的，可成為潛在的抗病毒藥物研發靶點。

此次研究中，研究團隊還對百年老葯蘇拉明體外抗埃博拉病毒活性的分子機制進行了探索。

蘇拉明是20世紀初由德國化學家保羅·埃利希首次分離出來的一種無嗅、無味的白色粉末，可溶於生理鹽水中，後來被發現可用於治療多種寄生蟲病，從20世紀20年代初被廣泛用於治療非洲昏睡病和盤尾絲蟲病等寄生蟲病。近年來，科學家發現蘇拉明具有抗新冠以及癌症活性。前期初步研究提示蘇拉明也具有抗埃博拉病毒活性，但其作用機制不甚清楚。

研究人員通過體外酶活和細胞複製子實驗，發現蘇拉明能有效地抑制埃博拉病毒聚合酶活性，並進一步利用冷凍電鏡技術解析了埃博拉病毒聚合酶與蘇拉明的複合物結構，揭示蘇拉明是通過結合在聚合酶的NTP進入通道，阻礙底物進入酶活中心而發揮抑制作用。蘇拉明藥物與L蛋白相互作用的分子細節，為進一步改造和優化蘇拉明藥物提供了關鍵參考信息。

“蘇拉明是一種潛在的抗病毒藥物，這項研究的一個亮點是解析L蛋白與蘇拉明的複合物，這可以指導進一步的抗病毒藥物設計。”該論文一位審稿人說。另一位同行評審人則表示，埃博拉病毒L蛋白結構信息的缺乏一直是該領域公認的空白，這項研究提供了重要的信息，有助於促進基於結構的抗病毒藥物設計。